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大肠菌群实验步骤？

所谓大肠菌群，是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群zui近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。

材料与器皿

(—)培养基

1、普通乳糖蛋白胨培养液

蛋白胨 10g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。

将蛋白胨、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。

2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。

1、 品红亚硫酸钠培养基(供平板分离用)

蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15～20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5%的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊红美蓝培养基(EMB培养基)(供发酵法平板分离用，3和4可任选一种)

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2%伊红(曙红)水溶液 20mL，5%美蓝(亚甲蓝)水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培养皿。

微生物菌种实验过程

(一)水样的采集

供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h ，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。

1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min ，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。

(二)初发酵试验

1、水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。

2、接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL， 小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。

3、结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。

若实验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。

(三)平板培养试验

将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培养物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基平板上，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：

(1)划线间距至少相隔0.5厘米;

(2)接种钉要稍弯;

(3)先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣;

(4)划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面.以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于37℃培养18～24h。

24h后，观察在平板上出现的单个菌落，其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37℃培养24h。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在.

(四)复发酵验证实验

经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培养基的试管中，在37℃培养24h，阳性反应者即确认为大肠菌群细菌。

微生物菌种结果计算

在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观察，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管”)删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。

如果初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水样100mL中大肠菌群指数(MPN)。如果接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。

大肠杆菌和菌落总数培养温度到40度有影响吗？

由于该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。

给个参考吧 ：食品上使用超高温灭菌法（ultrahigh temperature sterilization），将牛奶或乳制品以140~150℃加热1~3秒，经过这样灭菌过程的牛奶或乳制品不需冷藏，可在室温下保存约2个月。

单从大肠杆菌看通过将食物的所有部分均加热至摄氏75度，便可消灭大肠杆菌O157 : H7；因此，碎牛肉及汉堡扒应彻底煮至摄氏75度达2至3分钟，直至煮熟的肉完全转为褐色，而肉汁亦变得清澈。

实验室灭菌用高压灭菌锅在工作蒸气压力0.5 MPa，温度≤142℃的情况下灭菌（不同的培养基灭菌时间和温度是不同的）

菌落总数的测定步骤？

一是稀释度的选择。液体样品可直接取原液进行检验；固体或者半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1:10,1:100,1:1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：10000甚至更大）。

二是空白实验。分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照，若空白有菌落生长则该实验无效。

三是培养基的倾注。根据对样品污染情况的估计，若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

四是菌落总数的计算。

大肠菌群的计算方法举例说明？

1.MPN法

　　MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

　　2.平板计数法

　　大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

做菌落总数测定进无菌室前需要做哪些准备？

首先，准备灭菌的生理盐水（9ml）。

其次，灭菌的营养琼脂培养基，涂布（固体培养基，营养琼脂平板，涂布棒），倾注（液体培养基，灭菌的空平板）

再次，灭菌的枪头

样品处理：看你是要做什么样品

无菌室要提前灭菌，操净台要灭菌开紫外灯半个小时左右

巴氏消毒法国家标准？

巴氏消毒法指利用低于100℃的湿热杀灭微生物的消毒方法。 巴氏消毒法为61.1～62.8℃作用30min，或71.7℃作用15～30min。这样处理后，可将其中的非芽孢病原菌杀死。此法主要用于在高温下容易被破坏的流质食物及药品。

1．适用范围

适用于对不耐高温的流质食品（如牛奶等）、奶瓶、棉织物（如医院的床单、被罩、医生的工作服）、清洁工具、便盆、尿布等物品的消毒。在生物医学中巴氏消毒法可用于血清的消毒和疫苗的制备

2．使用要求

对流质食品，可直接在巴氏消毒器或其他加热容器中加温消毒。对物品、用具或包装的流质食品可完全浸没于巴氏消毒器或其他加热容器中加温消毒。对物品或用具也可摆放在密闭容器中，通入热蒸汽进行消毒。

常用的加热温度与作用时间为：60～62℃，30 min；70～72℃，20 min；80～82℃，10 min。在生物医学中，用于血清的消毒和疫苗制备，对血清加热56～60℃，作用60 min，每天1次，连续3天，能使血清不变质。

瓜子大肠菌群的检测方法？

进入无菌室步骤

1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。

2．关灯后0?5小时后放可进入。

3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套

实验步骤

1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）

2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。

3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）

4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）

5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）

6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液

7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）

8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）

9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）

10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）

11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成

－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成

－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样

12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）

13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。

14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）

15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。

16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气